Lluís Montoliu, Francis Mojica y Juli Peretó: «Hemos empezado a corregir versículos de la Biblia genómica con la edición por CRISPR»

Tal vez nunca antes las paredes del Centre Octubre de Cultura Contemporània, en el corazón del histórico barrio del Carmen en el centro de Valencia, hayan tenido la oportunidad de vivir una conversación con tal carga de profundidad sobre los límites de la vida, su esencia mínima, los aprendizajes del mundo ancestral o las perspectivas de la biomedicina del futuro más próximo. La excusa para encontrarnos aquí ha sido la presentación del último libro de Lluís Montoliu (Barcelona, 1963), en el que desvela los secretos de una técnica que ya está revolucionando el mundo, la edición de genes, basada en la lucidez de las observaciones que realizó Francis Mojica (Elche, 1963) en las arqueobacterias de las salinas de Alicante. Completa el trío de ases de la biología molecular Juli Peretó (Alzira, 1958,) que nos ayuda a entender, desde una visión evolutiva y de la biología de sistemas, qué es la vida y cuál es el paquete mínimo de condiciones para que esta se abra paso en un entorno dado. Lluís es investigador científico del CSIC y uno de los mayores expertos en investigación sobre albinismo. Francis, profesor titular de la Universidad de Alicante, aglutina premios y reconocimientos desde su descubrimiento del mecanismo de CRISPR, como el Albany Medical Center Prize, el galardón más importante en los Estados Unidos en el campo de la investigación médica. Los trabajos pioneros de Juli han permitido, a la postre, que institutos punteros de investigación hayan sido capaces de sintetizar el primer organismo artificial del planeta. Y los tres reflexionan sobre las bondades y los peligros de la investigación en genética.

¿Es la genética, y la biología molecular como nueva concepción de la genética, la rama de la ciencia que más está cambiando en las últimas décadas?

Montoliu: Sydney Brenner decía que la ciencia avanza fundamentalmente cuando hay cambios tecnológicos. Yo estoy de acuerdo con esto. Un ejemplo donde ha habido cambios tecnológicos importantes recientemente ha sido en la genética. Ahora tenemos un control de la modificación de los genomas que antes no teníamos, en cualquiera que fuese la especie, pero si me hubieras hecho la pregunta hace unos años te hubiera dicho que la revolución estaba en la biología del desarrollo, porque la transferencia de núcleos y la reconstrucción del embrión que dio lugar a la oveja Dolly en su momento fue otro hito importante que nos cambió la perspectiva de cómo se desarrollan los embriones, y dio paso a la medicina regenerativa, a las células IPS, a células pluripotentes… Con lo cual, ahora mismo la genética tiene una explosión propiciada por los descubrimientos que hizo este señor [refiriéndose a Francis Mojica] hace veintiséis años, y que hace unos siete años se trasladó al común de los mortales. Durante más de veinte años estuvo esto dentro del ámbito de los microbiólogos, un ámbito específico, hasta que alguien lo leyó desde otro punto de vista, desde otro ángulo, y se dio cuenta de que aquello que servía a las bacterias para defenderse de virus y plásmidos, pues también tenía una utilidad de edición. Y en eso estamos.

Peretó: Si la pregunta se hubiese formulado, en lugar de a biólogos moleculares, a informáticos o a expertos en computación, pues claro, hablaríamos de todo lo que hace referencia a la robótica, a la inteligencia artificial, que son también tecnologías disruptivas en este momento. Y visto desde esa perspectiva también se podría decir que se está viviendo un momento de transición de fase, que nos movemos hacia un mundo que está por descubrir. Y respecto a la biología molecular, simplemente decir que en el libro La historia de la biología molecular de Michel Morange, que es una referencia para mí, este epistemólogo y biólogo molecular francés, en su segunda edición, incluyó un epílogo que se llamaba «Réquiem por la biología molecular» porque él pensaba que la convergencia de todas las tecnologías, de edición de genomas, de secuenciación, de síntesis de genes, son tecnologías que están produciendo unos avances tremendos, y él sugería que probablemente estamos asistiendo a la desaparición de la biología molecular y a la «resurrección» de la verdadera biología, que sería como devolverle la vida a los genomas. Es decir, con la información digital de los genomas no es suficiente para entender cómo funciona una célula, ni siquiera la más pequeña, y necesitamos lo que se llama la biología de sistemas, la integración de toda esa información, que sin las ciencias de la computación tampoco podría existir. Yo creo que hay una convergencia de todas las tecnologías, que hace que emerjan campos nuevos y sobre todo maneras diferentes de abordar un problema tan simple como definir cómo podemos pasar del genotipo al fenotipo, que es muy fácil de decir pero muy difícil de hacer.

Y, Francis, ¿tú cómo lo ves desde tu punto de vista, desde el mundo de los procariotas?

Mojica: Yo, desde mi punto de vista, voy a recordar el momento en el que se hizo pública la secuencia del primer genoma de un microorganismo, en el año 1995. Entonces estaba haciendo yo el postdoc en Oxford, y mi jefe que trabajaba en procariotas, y también en eucariotas, de hecho el laboratorio se dedicaba a fibrosis quística, nos reunió a todos los microbiólogos del grupo y nos dijo que nos teníamos que replantear todo lo que estábamos haciendo, que acababa de salir un artículo que publicaba la secuencia de un genoma diminuto, de una bacteria muy pequeña y tampoco demasiado importante, pero que había que replantearse los experimentos. Cuando volví a Alicante, mi jefe, Francisco Rodríguez Valera, que también era conocedor de esta publicación, me dijo que no había que replantearse nada, sino que teníamos que olvidarnos de todo lo que estábamos haciendo y pasarnos a esta nueva revolución, que había que secuenciar, que de repente íbamos a tener toda la información que estábamos buscando con tanto esfuerzo. Antes encontrábamos algunas páginas de los libros y ahora íbamos a tener toda la información, y que había que aprovecharla, y que ya no necesitábamos gastar tanto esfuerzo, tanto tiempo, tanto material y tanto dinero.

Eso fue en el año 1995 y tan solo seis años después ya teníamos el primer borrador de la secuencia del genoma humano. Fue una cosa rapidísima.

Peretó: Y de hecho la secuenciación del genoma de Escherichia coli, que había supuesto un montón de tiempo y el trabajo de un montón de gente, digamos que se publica un poco porque hay que hacerlo, pero en ese momento ya secuenciar genomas bacterianos era casi rutinario y hoy en día hay miles y miles de genomas. Un aspecto adicional que me ha venido ahora a la cabeza al hablar de Rodríguez Valera es el beneficio que ha supuesto también para la biología el reconocimiento de la diversidad microbiana, porque hasta el momento de la metagenómica o de la genómica ambiental lo que era cultivable era lo conocido, pero es que ahora es una inmensidad…

Montoliu: … un universo, se abre un mundo que no sospechábamos, de varios órdenes de magnitud. Tú puedes secuenciar los genomas de bacterias, de arqueas, de bichos que no puedes cultivar, pero están ahí, puedes extraer ADN, puedes amplificarlo, puedes secuenciar y puedes tener la maravilla de información y la diversidad y complejidad de cosas que te estabas perdiendo.

Peretó: Para mí el ejemplo de los ejemplos es que gracias a la secuenciación sabemos que hubo una especie humana que los paleontólogos nunca habrían descubierto, y que se obtuvo a partir de un fragmento pequeñito de una falange, que como fósil es imposible de deducir qué es. Así que los denisovanos se han descubierto secuenciando el genoma del ADN que contiene ese fragmentito, de manera que mientras la paleontología nunca nos habría descubierto a los denisovanos, la genética nos los ha puesto encima de la mesa, y encima sabemos que hibridaron con humanos igual que los neandertales. Es que cuando miras atrás…

Claro, yo me acuerdo de los ochenta, con los enzimas de restricción, lo que entonces se llamaba la tecnología del ADN recombinante. En aquella época apareció la PCR, que parecía el descubrimiento del siglo, y esto nos ha posibilitado lo que tú nos estás contando.

Montoliu: Cuando lo de la PCR yo estaba empezando la tesis y mi director de tesis, Pere Puigdomènech, vino un día de un congreso de Estados Unidos y dijo: «Hay una técnica que nos va a cambiar la vida a todos». Y empezamos con ella. Empezamos nosotros con unos baños a diferentes temperaturas y con unos cronómetros, y cambiando los barquitos y haciendo una amplificación manual, mucho antes de que salieran las máquinas que tenemos hoy en día. La PCR quizás es otro ejemplo de tecnología disruptiva en genética. Ahora no se concibe un laboratorio de biología que no tenga una máquina de PCR o no lo use para alguna aplicación, algo parecido está pasando con la edición, de la que hay múltiples aplicaciones, algunas insospechadas, incluso algunas que están fuera de lo habitual. Cada laboratorio lo va a usar de manera distinta.

Ya que hablamos de edición, Francis, cuéntanos qué es CRISPR.

Mojica: CRISPR es el acrónimo de unas repeticiones muy particulares, muy peculiares. Simplemente por la disposición que tienen ya de por sí llamaron la atención de algunos, de unos pocos, ya que se encuentran de una forma regularmente espaciada. Repeticiones hay en todos los seres vivos, en eucariotas no te digo nada… y en procariotas también, pero que se mantenga una disposición regular como mínimo mosquea. Lo que pensamos inicialmente fue que esa distribución era más importante que la secuencia que hay entre las repeticiones, craso error, como suele ocurrir en ciencia muchas veces. Lo que descubrimos después de muchos años es que no la distancia sino lo que hay entre una repetición y la siguiente es lo que determina la funcionalidad de aquello, que no es ni más ni menos que un baúl de recuerdos de infecciones pasadas. En algunos casos estamos hablando de miles de generaciones atrás del mismo microorganismo, que adquirió un fragmento de ADN procedente de un invasor, que puede ser un plásmido, puede ser un virus, y que guardó en parte solamente un trocito o varios dentro de esa caja de memoria, y que luego le sirve para reconocer un invasor relacionado con aquél y destruirlo.

 

Yo creo que he leído, pero no sé si es cierto, que a Kary Mullis se le ocurrió la PCR cuando iba por un bosque, conduciendo por una de esas carreteras largas de los Estados Unidos. ¿Cómo llegáis vosotros a la conclusión de la funcionalidad de CRISPR a partir de la identificación de las secuencias? ¿Cómo fue vuestro eureka, tipo revelación como Mullis?

Mojica: El eureka llegó, pero diez años antes del eureka fue una frustración tras otra. Cuando vimos aquel patrón de repeticiones regulares yo estaba un poco sesgado, porque estaba muy interesado en la estructura del ADN. Luego las cosas pasan de moda, pero en aquel momento la topología del ADN estaba muy de moda, o a mí me parecía de lo más interesante, y pensaba que se podía explicar todo lo que no entendíamos con la topología del ADN, como la regulación de la expresión génica. Y eso era lo que a nosotros nos interesaba cuando estudiábamos los microorganismos de las salinas, pensábamos que los cambios en salinidad del medio producían un cambio global en la estructura, y este un cambio global en la expresión que explicaba el fenotipo tan distinto que había entre un mismo microorganismo crecido en diferentes salinidades. Y dijimos «esto tiene que ver con la estructura, seguro». Pensábamos que una estructura regular con repeticiones, que encima son parcialmente palindrómicas, que pueden formar estructuras de lazo y tallo, podrían servir en una disposición regular para el reconocimiento de proteínas, para la unión a membranas, a algo topológico. Y luego resultó ser totalmente erróneo, y durante muchos años probamos a ver si aquello afectaba a la topología y res de res, en absoluto.

Luego vimos que haciendo experimentos con estos halófilos extremos raros, con los que podíamos hacer dos cosas y media ya que no teníamos herramientas de biología molecular, de hecho casi no las hay todavía, y de hecho CRISPR es una de las pocas, comprobamos que parecía que tenía algo que ver con algo que no se conocía en aquella época, que era garantizar la segregación de los cromosomas entre células hijas. Todos los experimentos tenían buena pinta y llevaban en esa dirección, y a veces uno se plantea que los experimentos son muy importantes, pero luego resulta que cuando descubrimos que aquello era un sistema inmune no fue por los experimentos sino por observaciones, y es cuando empezamos a atar cabos. O sea, los experimentos nos llevaban en una dirección y gracias a la disponibilidad de secuencias de muchos microorganismos llegamos a saber de dónde venían los espaciadores. Y eso fue lo que nos dio la pista para saber que esos espaciadores, que procedían de invasores, estaban relacionados con inmunidad, ya que comprobamos que nunca se había descrito una infección eficaz del virus que llevaba esos fragmentos y que habían guardado los ancestros de los posibles huéspedes. Y como no podían infectarlos dedujimos que realmente era un sistema inmune.

Montoliu: Has dicho que has estado diez años intentando avanzar, pero equivocándote, persiguiendo hipótesis que luego no se confirmaban. Y eso ilustra muy bien el devenir del científico normal, ya que vivimos en un permanente fracaso, y solo hay chispas de éxito que aparecen muy de tanto en tanto, y hay que saber reconocerlas cuando aparecen, hay que saber aprovecharlas, pero en general el estado natural del científico es el fracaso, el estado natural del científico es un experimento que no sale, y lo que no sale es lo que te hace avanzar.

Pero este señor no hizo chispas, hizo un incendio.

Peretó: Hizo una mascletá. Esta es también una manera de describir la situación en ciencia. La ciencia no solo es ver y observar cosas, sino pensar cosas que nadie había pensado para explicarlas.

¿Y qué estabas buscando cuando encontraste las CRISPR?

Mojica: Agárrate. Estamos hablando del 92-93. Secuenciar en algunos sitios sería más o menos fácil, pero en la Universidad de Alicante no habíamos secuenciado nunca. Mi jefe en ese momento dijo que debíamos dar el paso a la biología molecular. Nosotros no habíamos hecho nunca nada de biología molecular serio, por la ausencia de herramientas para trabajar con halófilos. Y nos dijo que había que empezar a secuenciar. Y secuenciar supone poner a punto una cosa que para nosotros es casi un misterio sin posible solución, de hecho, recuerdo que las primeras secuenciaciones pedimos ATP en vez de dATP.

Montoliu: Esos pequeños detalles.

Peretó: Total, por una letra.

Mojica: El caso es que habíamos identificado unas regiones en el genoma de esos bichos con esas librerías que teníamos en aquella época, que parecía que sufrían una modificación epigenética, probablemente una metilación, que era sal dependiente. Dependiendo de la salinidad con la que habían crecido se metilaban o no en unos determinados sitios que nosotros detectábamos porque se cortaban o no con unos enzimas de restricción. Entonces teníamos localizados algunos de esos fragmentos y pensamos en secuenciar para ver si veíamos algo, con la esperanza de encontrar algún gen que se pareciera a algo conocido y que pudiera estar relacionado con la adaptación a la sal. La idea era que si algo se modifica cuando cambia la salinidad a nivel epigenético, y eso puede afectar a la expresión, pues entonces ya teníamos la respuesta a la pregunta que estábamos formulando de cómo se adaptan a nivel global estos microorganismos a distintas salinidades. Secuenciamos, yo te diría, unas 5 kilobases como máximo y dentro de esas 5 kilobases de las primeras que secuenciamos nos encontramos con esas repeticiones.

Y con tu herramienta de trabajo, que son las arqueas, entiendo que llevabas mucho más tiempo trabajando.

Mojica: Sí, yo empecé mi tesis en el año 1989.

¿Con arqueas ya?

Mojica: Con arqueas ya, con halófilos. De hecho, empecé la tesis con un tema que no tiene nada que ver con este, yo creo que lo he contado en alguna ocasión. Estos halófilos cuando los miras al microscopio te ciegan. Dependiendo de la salinidad producen vacuolas de gas, que son muy refringentes, y a otra salinidad no producen nada de vacuolas de gas. A mí me interesaba ver cosas relacionadas con la adaptación a la sal, cómo regulan esa transcripción, identificar a los genes que están implicados en la síntesis de estas vacuolas… y ese fue el proyecto de tesis inicial. Pero salió publicado un artículo que explicaba exactamente lo que nosotros pretendíamos hacer. Y nos cabreamos mucho, porque sospechábamos que era alguien que se le había ido la lengua en algún congreso y que había contado lo que estábamos haciendo y nos habían ganado la batalla

¿Y cómo le explicas a alguien que estás trabajando con arqueas de salinas, estudiando su secuencia genética y acabas descubriendo una herramienta que, por lo menos potencialmente, te permite curar enfermedades humanas? Esto es una reflexión importante para cualquiera que no sepa cómo funciona la ciencia.

Mojica: Sí, o para aquellos que nos denegaban los proyectos cuando decíamos que queríamos estudiar una repetición en halófilos. Y me decían «pásate a un organismo modelo». Pero mira, es que este es mi organismo modelo. Mira, estoy trabajando con este bicho, tiene un montón de repeticiones, he visto otros que tienen cuatro o cinco, pero en estas he visto las transcripciones y están transcribiendo en todas las condiciones que probamos, están activas, están funcionando. Y me decían que me pasara a un organismo modelo, a E. coli por ejemplo, y nos pasamos a E. coli donde el sistema no funcionaba y a día de hoy todavía no sabemos en qué condiciones naturales el sistema está funcionando. Ahora acaban de publicar un artículo que dice que en los halófilos ocurre un mating, es decir hay una transferencia de cromosomas de unas especies a otras, donde el sistema CRISPR está interfiriendo en esa adquisición del ADN, que eso es nuevo.

Montoliu: O sea, es el sexo de las halófilas.

Mojica: No solamente interfiere con la entrada de plásmidos o virus sino también con lo transferencia horizontal o mating. O sea, que tenemos una secuencias que enseguida supimos que eran raras, es decir que tener algo tan raro en un bicho raro es algo excepcional, y cuando te pones a buscar y ves que en E. coli, que divergió de estos halófilos hace más de tres mil millones de años, probablemente también había unas secuencias regularmente espaciadas, repetidas y del mismo tamaño, con la misma pinta y palindrómicas también, pues piensas que no puede haber habido una transferencia horizontal entre E. coli y este. Y luego vemos que en Mycobacterium tuberculosis, que también divergió hace unos cuantos miles de millones de años, también la tienen, pues eso nos llevó a pensar evidentemente que aquello era una característica ancestral y muy frecuente.

Peretó: Eso es muy importante también. El pensamiento evolutivo. No todos los biólogos moleculares o los microbiólogos tienen esa perspectiva y en ese caso, yo creo que fue crucial, Francis, que tú tuvieses esa perspectiva evolutiva.

Montoliu: Pero los microbiólogos holandeses que trabajaban en Mycobacterium o los japoneses que trabajaban con E. coli no cayeron en eso, aunque vieron unos patrones parecidos.

Peretó: Porque no tenían una perspectiva de la diversidad y de la evolución.

Mojica: Os voy a contar, en ese sentido, una curiosidad. Un investigador extranjero, que ahora ya está jubilado, me invitó a una tesis y me dijo que había sido revisor del artículo que al final publicamos en 2005, y que él lo echó para atrás y me lo confesó como diciendo «espero que no seas rencoroso, pero en ese momento yo no lo podía ver», y me lo dice: «no me lo podía creer y a día de hoy, y de esto hace ya ocho años, todavía no entiendo cómo fuiste capaz de verlo». Y yo le digo «pues lo que yo no entiendo es como tú no fuiste capaz de verlo». Y me dice «es que yo soy químico».

Desde vuestro punto de vista la perspectiva evolutiva fue clave en el descubrimiento.

Montoliu: Fundamental. Hombre, algo que está presente en procariotas, que no han coexistido y que derivan de las células originales, y estamos hablando de miles de millones de años y que sin embargo a día de hoy están presentes… Francis lo veía obvio, pero alguien tenía que decirlo. Si se ha mantenido esto tantos años es que es funcionalmente relevante, y caramba si era relevante, un sistema inmune de defensa adaptativo.

Mojica: Y chulo, y made in Alicante.

Y vosotros, Juli, trabajáis en algo que es un poco lo contrario, es decir, tratáis de conocer cuál es el número mínimo de genes para que un microorganismo pueda considerarse vivo. Es un camino, digamos, contrario al de la evolución.

Peretó: Bueno, se podría ver como contrario porque es un ejercicio de reconstrucción, como toda ciencia histórica, y la biología lo es. A partir de los documentos que disponemos, que son los genomas, tratamos de reconstruir esos estadios del pasado, en algunos casos incluso experimentalmente, porque se puede resucitar una proteína ancestral o se puede revisitar una condición. El ejercicio de los genomas mínimos tiene dos vertientes; una es la de reconstruir genomas mínimos recientes, o relativamente recientes, de antepasados comunes de bacterias que han reducido sus genomas por procesos de parasitismo, de simbiosis; o el ejercicio más potente, que es el más difícil de hacer, que es irse a esas épocas donde todas las especies han derivado, lo que sería el ancestro común universal y que se ha popularizado como Luca. Y eso es muy fácil de decir pero muy difícil de hacer. Se trata de a partir de los genomas actuales, hacer una reconstrucción de ese retrato robot de las funciones que tendría ese ancestro universal.

Lo que pasa es que lo que Francis descubrió es algo que ha sucedido por la coexistencia de los distintos linajes con sus patógenos, con los virus en este caso o con otros elementos genéticos que se está descubriendo que también puede ser mecanismos importantes de regulación en el control. Lo que hay que ver son las historias paralelas desde las células ancestrales más o menos mínimas hacia los distintos linajes, que aunque nos dé la impresión de que va a dar estructuras cada vez más complejas, hay procesos de simplificación también, y eso es lo que nos llevó en nuestro caso a la primera propuesta de genoma mínimo en el año 2004, a proponer un esquema puramente teórico que luego han corroborado los distintos experimentos que se han ido realizando en distintos sitios, como en el laboratorio de Luís Serrano en Barcelona, o más recientemente en los trabajos que están haciendo en el Instituto Craig Venter. Ellos han fabricado realmente una célula mínima, en el sentido que tiene todos los genes necesarios y suficientes para vivir, y han reconstruido su metabolismo. Y eso es empírico, no es un ejercicio teórico. Pero lo bonito de eso es que es una manera de cuantificar nuestra ignorancia también, ya que ellos descubrieron al mismo tiempo que el treinta por ciento de los genes mínimos necesarios para que la célula funcione no sabemos lo que hacen. Eso se lo dices tú a un ingeniero informático y no lo puede entender; ese ordenador tiene un treinta por ciento de piezas que las necesitamos pero no sabemos lo que hacen, pero las tenemos que incluir.

Estás hablando del Mycoplasma laboratorium, que lo que hacen básicamente es sintetizar los genes e introducirlos en un micoplasma.

Peretó: Bueno, en realidad a lo que yo me refiero es a un genoma sintetizado químicamente con el repertorio mínimo de genes, que deriva de esta aproximación del Mycoplasma laboratorium, a este creo que le llaman «Synthia 3». La versión 3.0 es la que tiene los genes organizados de la manera que ellos han creído conveniente, de una manera artificial, incluso agrupados por funciones en el cromosoma, cosa que en la naturaleza no pasa. Pero ese treinta por ciento de genes tienen que estar, pero no sabemos por qué.

Montoliu: Aquí vuelve a haber una revolución tecnológica que desarrollan Venter y sus colaboradores al construir ese gran megaplásmido, que es un minigenoma, y empiezan con los sistemas de ensamblaje, las ligaciones tradicionales no servían, y empiezan ahí con el ensamblaje sistemático, con lo cual cambian incluso los métodos, se tienen que inventar nuevos métodos que nos permiten estos ensamblajes.

Peretó: Para acabar con esto, y desde el punto de vista tecnológico, hay que decir que estamos en la fase de plagiar genomas, yo creo que es muy importante dejar claro a la gente que no sabemos escribir genomas, sabemos plagiar. Craig Venter ha plagiado a Mycoplasma, y con eso ha hecho un genoma reducido. Porque sabe que Mycoplasma sobrevive en esas condiciones, aunque no entienda por qué. Los genes son los de Mycoplasma, aunque los cambie de orden o le cambie la composición de bases o sobrescriba los nombres de los autores con cosas divertidas, pero los genes no se los ha inventado nadie. Es lo mismo que el primer genoma de virus que se sintetizó químicamente, creo que era el de la polio, que era un genoma idéntico al virus natural. Nadie saber crear un virus mortífero, solo la naturaleza, los humanos no sabemos. Creo que en la divulgación hay que hacer un esfuerzo para hacer ver a la gente que hay peligros, hay riesgos, eso es evidente, pero no estamos en la fase en la que podamos crear piezas o elementos peores que los que la propia selección natural está haciendo cada día.

Y con esa analogía, ¿podremos ser capaces de plagiar organismos multicelulares en algún momento?

Peretó: ¿Y por qué no?

Porque la tecnología la tendremos…

Peretó: De hecho, hemos empezado a corregir versículos de la Biblia genómica con la edición genómica, corregimos versículos, palabras de forma individual, grandes textos o incluso capítulos, los capítulos nos cuestan más que las palabras o las frases pero todo es cuestión de evolucionar la técnica.

Y tú, Lluís, utilizas CRISPR como herramienta para generar modelos animales

Montoliu: Yo llego a CRISPR tras la versión anterior de unas herramientas de edición que no eran tan versátiles como CRISPR. Y esto ocurre mucho antes de que yo conozca a Francis. A mí me explota CRISPR en las manos como una herramienta que me permite resolver las preguntas que yo quería resolver. Yo quería preguntarle al genoma no codificante, al genoma oscuro, a la gran mayoría del ADN de nuestras células que no se suele entender, cómo podemos extraer un elemento de esa zona, cómo podemos eliminarlo. Esto nos había llevado veinte años, lo habíamos intentado de muchas maneras y habíamos fracasado, ¿ves? Otra vez el fracaso. Veinte años fracasando, de 1996 al 2015. Y en esos veinte años hay muchas tesis, hay muchos postdocs, hay mucha gente que ha estado picando piedra y que no ha tenido fortuna. Hasta que das con una herramienta que es capaz de localizar secuencias y para ello solamente necesita una guía de veinte ribonucleotidos, este es el quid de la cuestión. Nosotros aprovechamos lo que descubre Francis y sus colaboradores para identificar una secuencia única en el genoma, si somos capaces de identificar dos de ellas que están más o menos cercanas en el genoma, podemos promover que lo que hay en medio pueda saltar y esto, para nosotros, es gloria bendita porque nunca lo habíamos podido hacer, porque en el ADN no codificante lo que hay son repeticiones, por lo que es imposible saber dónde uno está, pero incluso en la zona más repetitiva del genoma con la ayuda de ordenadores se pueden encontrar unos segmentos de veinte o más nucleótidos que sean únicos, y para eso necesitas unas tijeras que te corten específicamente en esos puntos y esas tijeras son las CRISPR. Con lo cual a nosotros nos resuelve una pregunta biológica que no habíamos podido responder.

Luego el bonus plus del CRISPR es que de repente podemos utilizarlas para reproducir exactamente las mutaciones que acabamos de diagnosticar a una persona con una enfermedad rara. Esto para mí es soñar, nunca lo habíamos podido hacer. La tecnología que teníamos anteriormente para modificar genes era una tecnología poderosísima, tanto que quienes la describieron recibieron el Nobel en 2007, Evans, Capecchi y Smithies. Se lo dieron por haber desarrollado una tecnología que nos permitía eliminar genes a voluntad en células troncales pluripotentes embrionarias de ratón. Pero era una tecnología grosera, que nos permitía casi pegarle un bocado al gen, nos llevábamos un fragmento enorme y siempre dejaba rastros, no era limpio, y esta es una tecnología que nos permite hacer cosas sutiles. Por ejemplo, una persona que tiene una enfermedad rara resulta que tiene una condición genética poco frecuente porque una sola letra de su genoma la tiene fuera de sitio, o le falta una letra o esa letra está cambiada, pero todo lo demás del genoma lo tiene intacto y ¿cómo hago yo para reproducir ese cambio en un ratón? Pues no era fácil, anteriormente era prácticamente imposible, pero con estas tecnologías lo podemos facilitar y esto es lo que nos permite generar lo que nosotros hemos venido en llamar los animales avatar, porque utilizamos la metáfora de la película de ciencia ficción.

De alguna manera conecto a ese ratón con el paciente, evidentemente las cosas son mucho más complejas, pero respecto al gen soy capaz de reproducir en el ratón la mutación misma que tiene esa persona, y eso nos permite avanzar, en el sentido de que en medicina no hay enfermedades sino enfermos porque ¿qué es una enfermedad? Un conjunto de síntomas que aparecen en una población determinada, pero ni los síntomas son los mismos en cada persona, ni el alcance, ni la aparición de los mismos, con lo cual, son valoraciones estadísticas lo que hacemos para definir una enfermedad, así que la única manera de avanzar también en enfermedades raras de base genética es descender a cada uno de los casos, descender a los pacientes y poder modelizar a cada uno de ellos y la suma de todos ellos me va a servir para entender, primero, cuál es la etiología de la enfermedad, cómo se establece y, finalmente, qué es lo que puedo hacer para aliviar, o en el mejor de los casos, para curar.

Francis, nos habíamos quedado en el descubrimiento, tú lo descubres con tu grupo, lo publicas y ¿qué pasa entonces?

Mojica: Pues a partir de 2005 los investigadores empiezan a trabajar en este campo, un campo que era un desierto. Y vienen los grupos más punteros en microbiología en ese momento del mundo, tanto de Estados Unidos como de Europa. Los chinos tardan en venir un poco.

Ahora hablamos de los chinos.

Mojica: Y vienen unos grupos súper potentes, que se interesaron por el tema y empezaron a caracterizar cada uno de los pasos del mecanismo que estaba implicado en esa interferencia. Y en 2010 yo creo que ya sabíamos perfectamente cómo funcionaba, con lo cual ya conocíamos los detalles más importantes de cómo funcionaba el mecanismo.

¿Qué hacen Charpentier y Doudna?

Mojica: Emmanuelle Charpentier lo primero que hizo fue describir unas secuencias que se llaman tracrRNA, que ella las llamaba de otra forma por cierto, y que eran un elemento más de los sistemas CRISPR-Cas y que participaban en la generación de las guías que necesita Cas9 en concreto para encontrar el sitio con el que tiene que actuar; no solamente le hace falta la guía de ARN que coincide en secuencia con la de la diana, sino que necesitaba otra molécula de ARN que descubrió ella, pero que tampoco tenía claro que servía para reconocer la guía, sino para generar la guía. Y esa fue la primera contribución que hizo y la segunda ya fue, en colaboración con Jennifer Doudna, que es bioquímica y que ya había hecho algún estudio de estructuras de proteínas Cas. Desde antes ya se sabía que había otros aspectos fundamentales, pero que tenemos un sistema que corta ADN se descubrió en 2010 y hasta entonces, por mucho que digan, no lo sabíamos, lo sospechaban algunos pero no lo sabíamos.

Cuando ya supimos que cortaba ADN y que se necesitaba una guía para llevar esa proteína para que cortara el ADN, entonces ya tuvimos una situación en la que alguien, y ellas fueron las primeras, se podía plantear identificar cuáles eran los componentes de esos sistemas, y algunos son tremendamente complejos ya que incluyen diez proteínas distintas. Ellas escogieron los sistemas más sencillos que había, con cuatro proteínas, y estudiaron qué componentes eran los suficientes y necesarios para llevar a cabo precisamente una restricción programable de una secuencia concreta de ADN y vieron que necesitaban un tracr, que lo describió Emmanuelle, una guía, el Cas9 de este sistema concreto y con eso podemos cortar ADN. Y como ya se sabía desde hacía más de veinte años que cuando tú cortas el ADN en un eucariota fundamentalmente fomentas la reparación, pues ya lo tienes, ya se sabía que había otras herramientas que cortaban el ADN y gracias a eso podías editar, y ahora lo que tenías eran endonucleasas que cortaban un ADN y que tú podías programar muy fácilmente, si producías una rotura de la doble cadena se abría la posibilidad de editar, y eso fue la idea brillante que tuvieron, el gran mérito fue identificar los componentes necesarios para el corte. Y luego, lo que hicieron ellas, pero no otros que publicaron un artículo similar unos meses después, aunque enviado antes, fue incluir una frase que decía «esto se puede utilizar para editar ADN de forma programable».

¿Y Zhang qué hace? ¿Lo hace ya en ratones?

Mojica: Feng Zhang, que es un fenómeno, y George Church, publicaron dos artículos al mismo tiempo en Science en 2013, unos meses después de aparecer este artículo ellos lo aplicaron directamente ya en células eucariotas. Jennifer Doudna estuvo apretando para conseguir un artículo en el cual demostrara esto y lo acabó publicando, pero a finales de enero, un mes más tarde, con lo cual la carrera de demostrar la validación de estas herramientas la perdió. Lo que hicieron en 2012 fue in vitro, mezclar componentes y decir «voilá, hemos cortado».

Montoliu: Ha dicho una cosa Francis que es importante recalcar porque aquí hay que sumar piezas, aquí hay alguien que tiene que estar atento a la evolución de estas tecnologías y darse cuenta, como él se dio cuenta, cuando se descubrió el sistema inmune que esta pieza encaja con esta. En el año 1985 Oliver Smithies fue el que se dio cuenta de que abriendo el ADN en un sitio homólogo a la secuencia que tú querías integrar fomentabas la recombinación homóloga, así que lo de asociar corte de ADN a recombinación era ya un conocimiento que existía en el campo. El problema con un genoma enorme y con los enzimas que conocíamos era ver cómo hacíamos para cortar solamente una vez donde nosotros queríamos. Nosotros no teníamos las herramientas para cortar, empezaron a aparecer diez años más tarde.

En el año 1995 unos franceses del Pasteur descubren unas enzimas que se llaman meganucleasas, de la levadura por cierto, que cortan cada vez que encuentran una secuencia de unos 20 a 40 nucleótidos. Pero esto tiene versatilidad nula, porque o tienes la secuencia o no la tienes, con lo cual eso sirvió para demostrar que era posible pero no tenía mucha versatilidad. Muchos años después aparecieron las meganucleasas recombinantes pero nunca triunfaron porque coexistieron con CRISPR y con otros modelos que evidentemente les pasaron por la derecha. Pero es importante descubrir que había diferentes observaciones clave en el campo, y había que unirlas para ponerlas a caminar y para decir; es que yo utilizo este sistema de procariotas, sé que los eucariotas tienen sistemas de reparación que van a actuar a continuación y si esto lo pongo todo junto a caminar el resultado es que edito un gen.

Y mientras estamos en ese proceso de investigación reciente, mientras estamos trabajando en esto, de repente nos cae un jarro de agua fría de un chino que ha hecho una edición en humanos

Montoliu: Y el problema es que esto ha pasado realmente, durante unas semanas yo pensé, incluso dije por ahí, que esto tenía que ser un cuento chino, me gustaría que fuese un cuento chino y no es un cuento chino, es una realidad, ahora ya podemos confirmarlo, tenemos la confirmación de las autoridades chinas. Pero yo creo que nos equivocaríamos con el caso de este investigador si pensáramos que es un investigador solitario trabajando en un garaje, descamisado, que se le ocurre una idea loca y la lleva a cabo… Esto no es así, estamos hablando de un investigador que tenía centenares de millones de dólares, un investigador que tenía apoyo del gobierno regional, del gobierno federal, que estaba colaborando con muchos grupos en Estados Unidos, que estaba explicitando, explicando y contando lo que quería hacer, que con mayor o menor vehemencia los diferentes investigadores le decían «oye, esto es mejor que no lo hagas, esto no tendrías que hacerlo». Pero él decía que solo iba a editar unos embriones, y editar embriones in vitro ya se había hecho en abril de 2015, y bueno pues en el laboratorio esto es algo que incluso con nuestra ley de reproducción asistida humana en España es posible. Pero él pasó una línea roja y dijo «estos embriones los voy a implantar en una mujer y los voy a llevar a término». Pero él lo anunció y lo dijo, y se lo explicó a mucha gente, y ahora esa gente tiene que explicar y tiene que justificar de alguna manera cómo sabiendo que esta persona iba a hacer una barbaridad y una irresponsabilidad, que es lo que yo creo, le dejaron. En algún momento podremos pensar que la edición genética de embriones puede tener su utilidad, pero en este momento es una irresponsabilidad, a esta persona se la tendría que haber parado.

¿Y qué es lo que ha fallado, Lluís?

Montoliu: China es un país ultra competitivo, ríete tú de la competitividad occidental, la competitividad de China es feroz. Yo creo que hubo una sensación de decir «este es un experimento que nadie quiere hacer, pero alguien va a hacer, y dado que alguien lo va a hacer, que seamos nosotros».

Pero incluso en contra de las propias leyes chinas.

Montoliu: En China esto también está prohibido, no es cierto que esté facilitado, lo que pasa es que ahí se combina ambición con falsificación. La autorización que él mostró de un supuesto comité de ética que le había facultado para hacer ese experimento estaba falsificada, con lo cual ahí tenemos un problema grande. Yo creo que es una persona que fue empujada desde diferentes foros para que realizara este experimento, una persona ambiciosa, por cierto, que no era embriólogo, sino bioinformático y físico, y al que se le dotó de los equipos adecuados y que finalmente ha hecho el experimento. Pero tenemos el problema encima de la mesa, la pasta de dientes se ha salido del tubo, y ya no podemos meterla dentro. Ahora lo que tendríamos que hacer es poner normas para evitar que esto vuelva a ocurrir, y fomentar que exista una regulación. No es cierto que la ciencia no tenga que tener regulaciones, claro que tiene que tener regulaciones, porque tú desde tu casa no puedes pedir un isótopo radiactivo y que te lo envíen a casa, y toda la gente lo entiende, porque tú no tienes una instalación radiactiva en casa. Pero tú entras desde el ordenador a buscar unos reactivos CRISPR y a los dos días Fedex te entrega los reactivos que acabas de pedir. No tenemos esa conciencia todavía, no hemos generado esa regulación y quizás eso permite que existan estas corrientes, estas corrientes que aparecen en diferentes grupos, como el transhumanismo, la libertad total, que ningún gobierno o administración pueda decidir sobre mi libertad, si existe una tecnología, yo quiero utilizar esa técnica en mí mismo, los do it yourself.

Si no regulamos esto nos podemos cargar un futuro que todavía no está ahí, pero que estará en algún momento, y que realmente va a ser beneficioso y que va a generar probablemente estrategias terapéuticas para pacientes, pero podríamos desactivar ese futuro si empezamos a cometer barbaridades. Las herramientas de corte de Francis son extraordinariamente precisas y eso no es un problema, lo que no son tan precisas son las herramientas que actúan a continuación que son las que acaban produciendo la edición. Las herramientas que tenemos de reparación no son tan precisas y lo que es peor, no tienen memoria, no se acuerdan de lo que acaban de hacer, cuando acaban de reparar una molécula de ADN, se encuentran otra molécula de ADN parecida , con un corte parecido y empiezan a repararla de forma distinta, con lo cual coinciden en una misma persona un batiburrillo de secuencias, y esa persona acaba siendo un mosaico, un mosaico como una colcha de estas de patchwork, de cuadraditos. Y

o los mosaicos los sé gestionar bien en el laboratorio con ratones, pero no sé cómo gestionar los mosaicos en personas, no sé cómo puede ser que una persona tenga diferentes partes de su cuerpo con genes distintos en los cuales la inactivación o la reactivación haya ocurrido de forma diversa. Gestionar esa incertidumbre, trasladar el riesgo a pacientes en estos momentos es algo que tenemos que pensarnos dos veces. Las terapias que vamos a empezar a ver y las que están sobre la mesa son terapias esencialmente ex vivo , son esencialmente de células que se extraen del paciente, se hace la edición, y se puede seleccionar lo que queremos introducir al paciente, con lo cual tenemos algo de control. Si tratamos de introducir las herramientas de edición como hacemos con ratones en personas entonces perdemos todo el control. Cuando tengamos el control es cuando podremos administrarlas para unos tratamientos que no solo tienen que ser eficaces, sino sobre todo seguros.

Juli, yo sé que tienes especial predilección por el mito de Frankenstein. Y aquí ha pasado un poco como en la novela de Mary Shelley, es decir, todo lo que puede hacer un científico puede acabar ocurriendo. ¿Dónde crees que está el límite? ¿Lo tiene que poner el propio científico? ¿Son los comités de ética los que deben regular?

Peretó: Hombre, es un tema complicado, Frankenstein es una metáfora fantástica de la irresponsabilidad del científico. El monstruo, la creación del doctor Frankenstein, en principio no es malévolo. Se vuelve maléfico con el entorno de rechazo, empezando por el propio creador, el creador que ha hecho ese esfuerzo científico de llegar a conseguir una cosa que nadie había conseguido antes, que es dotar de vida a un ser inerte. En el justo momento en que el ser llega a la vida, lo rechaza, no le da ninguna opción, por lo tanto yo creo que aquí hay un primer problema de responsabilidad. Yo creo que todos los esfuerzos que hagamos, que hoy en día no se hacen los suficientes, en formación son pocos, porque nos preocupa mucho que nuestros estudiantes sepan cuántas subunidades tiene la ADN polimerasa, y cosas por el estilo, y eso está muy bien, pero está en la Wikipedia. Queda mucho por hacer en la formación humana de los científicos.

Ayer, precisamente escuchábamos a Carme Torras, que es especialista en robótica y ella tiene una línea muy fuerte de educación ética a los ingenieros, hablar de lo que llaman la roboética. Pero la bioética existe desde mucho antes que la roboética ¿y esa bioética llega suficientemente a los científicos en formación? ¿o nos preocupa que esté solo ejercitada por unos comités que velan por ella?, es lo que decía antes Lluís de los isótopos que te llegan a casa, los comités de control hacen falta, las supervisiones previas de los proyectos hacen falta, pero puede pasar también como los tratados internacionales de proliferación de armas atómicas. Es decir, y si hay un país que no firma los acuerdos o moratorias ¿qué hacemos? Yo creo que son muchos los frentes que hay que abordar, el de formación de los científicos, que yo creo que hay mucho que hacer ahí, el de los acuerdos internacionales y el del funcionamiento correcto de todos los comités institucionales.

Montoliu: Eso es lo que intentamos promover, hemos lanzado una asociación que se llama Arrige que lo que pretende es promover y extender el uso responsable de las técnicas de edición genética, que es exactamente lo que estabas diciendo tú. No todo lo que podemos hacer lo debemos hacer, y uno tiene que autolimitarse. Hay experimentos que técnicamente son posibles pero que éticamente no son aceptables. Y esta es una formación que hay que impartir a los científicos, porque la edición es una herramienta poderosísima que utilizada malévolamente o inadecuadamente puede generar mucho daño. La edición genética puede generar muchos problemas, pero también puede servirnos para controlar plagas de mosquitos y disminuir el impacto de la malaria, y esto es positivo. Vamos a intentar promover el uso responsable de estas técnicas, y si todavía no podemos controlar la salida del final de la edición, pues no debería ser oportuno utilizarla en embriones humanos, dejando aparte que sea legal o no legal en unos países y en otros no, no es prudente utilizarla con esta tecnología todavía.

Y luego, en el campo de la biología lo que más alegrías nos está dando y que más herramientas nos está aportando en los últimos tiempos son los microorganismos, especialmente aquellos más antiguos como las arqueas o, incluso, los microorganismos extremófilos. Este es un campo donde seguir buscando herramientas.

Peretó: Yo soy un convencido de eso, porque incluso he ayudado a fundar una empresa que busca precisamente eso, encontrar nuevas moléculas, nuevas funciones en el mundo de los microorganismos que la hemos llamado Darwin, por cierto, esto es publicidad (risas). Hoy en día tecnológicamente se nos abre un mundo, un universo diría yo, de diversidad biológica por conocer, por caracterizar, por entender y que puede seguir dando herramientas. Las herramientas CRISPR son un ejemplo muy bonito de para lo que sirve la persistencia y perseverancia en investigación básica, aunque algunos evaluadores pensaron que no servía para nada si no era en una bacteria más conocida. Gracias a que hay gente que es cabezota y que insiste que hay que saber el por qué de las cosas, de manera inesperada alcanzamos una verdadera revolución. Eso ya pasó con las enzimas de restricción y con muchos otros ejemplos de gente muy perseverante en entender el mecanismo. Los enzimas de restricción son otro sistema de defensa que estaban estudiando para ver por qué las cosas eran así, y resultó ser una herramienta fantástica para cortar genes. Y este es el mensaje que hay que dar, la biología como tal, el estudio de la vida, y en este momento histórico, inaccesible hasta hace muy poco para nosotros con las herramientas de la genómica, nos va a seguir dando sorpresas. Yo no tengo ninguna duda, no hay ninguna razón fundamental para pensar que ya lo hemos descubierto todo. Ni mucho menos lo bueno, lo beneficioso y lo útil está todo descubierto. Creo que la biología está llena de sorpresas y nos las seguirá dando. Si se te ocurre algo que pueda pasar, búscalo en un mundo microbiano y lo encontrarás. Los microorganismos llevan tres mil quinientos millones de años explorando e inventando cosas y son más diversos.